一文读懂 KO Pool：高效细胞基因敲除的核心方法_风闻

一文读懂 KO Pool：高效细胞基因敲除的核心方法

什么是 KO Pool？

KO Pool 是一种在细胞群体中批量敲除目标基因的策略，跳过了单克隆筛选环节，大幅简化实验流程，并显著加快了功能验证进度。

KO Pool 的主要优势包括：

无需单克隆挑选，节省大量时间与资源

高效敲除目标基因，直接进行表型检测

快速获得生物学响应，适用于初筛和快速验证

敲除效果稳定且彻底，在许多场景中优于RNAi干扰

KO Pool 技术的典型应用场景

高质量的KO Pool体系适用于多种生物医学研究任务，尤其在以下领域表现突出：

1.****细胞增殖与存活评估快速判定基因敲除对细胞生长和代谢的影响。

2.****功能基因筛选与信号通路解析适用于高通量分析关键基因，识别潜在的致病因子或信号路径。

3.****药物靶点筛选与验证通过基因敲除快速定位潜在靶标，辅助药物开发与机制研究。

4.****疾病模型构建可在原代细胞或iPSC中敲除相关基因，用于模拟疾病状态或表型。

5.****抗体验证与蛋白功能研究用于明确目标蛋白的敲除效果，检测抗体特异性及下游影响。

KO Pool 构建的高效解决方案

目前业内已有成熟的基因编辑平台专门用于高效构建KO Pool体系，其优化技术通常包括以下几个方面：

1.靶向设计算法优化根据目标细胞的基因组结构和表达图谱，设计高效打靶位点，提升敲除效率。

2.****双gRNA协同编辑采用相邻位点的双gRNA配对，显著增强双链断裂频率，提高敲除完整性。

3.****标准化细胞编辑流程针对不同类型细胞系（包括难转染细胞）建立优化流程和参数库，提升成功率。

4.无偏差****检测系统结合qPCR、NGS、质谱等方法，全面评估编辑效率和敲除结果。

5.****单细胞基因型识别技术适用于单克隆筛选或进一步功能验证，确保数据可靠性。

图1: 定制CRISPR-U™ KO pool的工作流程案例分析：PDXK基因在HepG2细胞中的敲除效果对比

在一项针对HepG2细胞系的研究中，科研团队通过双gRNA策略构建了PDXK基因的KO Pool，并与3株独立的PDXK单克隆细胞进行了比较。

蛋白质组学分析结果显示：

KO Pool样本的重复性更好（标准差更小，见图1A）

KO Pool识别出6种显著下调蛋白，而单克隆仅发现4种

KO Pool表型更接近细胞群体平均状态，更适合用于早期筛选和系统分析

应用提示与注意事项

尽管KO Pool策略在短期功能研究中表现出色，但在需要长期稳定表达、研究突变背景或开展精细功能解析时，构建稳定的单克隆系仍是必要步骤。此外，为避免出现误判敲除结果的情况，建议使用蛋白质组学手段确认是否存在截短蛋白或外显子跳跃现象。

图2: PDXK-KO细胞的蛋白质组学表型

小结：KO Pool 为RNAi提供更理想的替代方案

作为CRISPR技术的一种高效应用形式，KO Pool平台在高通量筛选、功能验证和早期药物研发中展现出卓越的效率与可扩展性。相比RNAi，KO Pool具有更强的稳定性与特异性，更符合现代功能基因组学的研究需求，是当前探索基因功能的理想解决方案。