(KO)敲除细胞系构建：从CRISPR/Cas9到高效编辑策略_风闻

2020年，诺贝尔化学奖授予了CRISPR/Cas9技术的两位科学家，这项被称为“基因剪刀”的技术，正在深刻改变基础科研、疾病治疗、农业育种等多个领域。它不仅实现了对DNA的精准修饰，还让基因功能研究进入了高效、低成本的新阶段。

在基因编辑不断发展的今天，如何构建高质量的敲除（Knockout, KO）细胞系，成为研究人员突破课题瓶颈的关键。本文将全面梳理KO细胞系构建的技术原理、操作策略、常见应用以及面临的挑战，助力科研实践更高效推进。

CRISPR/Cas9简析：基因编辑的利器

1. 来源机制：源自细菌的天然“免疫系统”

CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）起初是细菌为抵御病毒而进化出的适应性免疫机制。病毒DNA侵入后，细菌将其片段整合进自身基因组并形成“记忆”，未来再次遭遇同一病毒时，可通过crRNA引导Cas9蛋白精确识别并切割病毒基因。

这一天然机制被科学家转化为强大的基因编辑工具。人工设计的sgRNA（单链向导RNA）可引导Cas9蛋白靶向并切断任意基因，利用细胞的修复机制实现基因敲除或敲入。

2. 技术优势：简单高效，适用广泛

操作简便：只需设计一段20bp的sgRNA，即可实现精准定位目标基因；

适用多种物种：涵盖人类、动植物、酵母等；

性价比高：相较ZFN和TALEN，成本大幅降低，门槛更低。

sgRNA的设计：精准编辑的关键第一步****1. 设计原则

优先选择靠近ATG起始密码子的外显子区域；

回避重复序列及GC含量极端区域，优化编辑效率；

对于存在多个转录本的基因，选择保守外显子区域；

避免选择与其他基因有高同源性的区域，降低脱靶概率；

借助在线工具预测gRNA效率与特异性，进行精筛。

2. gRNA数量选择方案

单gRNA移码敲除：适用范围广，操作简便，但对非编码区与短外显子效果有限。

双gRNA小片段敲除：可直接通过PCR长度差判断编辑成功，准确率更高。

多gRNA大片段或全基因敲除：彻底破坏功能，但设计复杂，编辑效率受限。

敲除细胞系构建优化策略构建敲除细胞过程中常遇难点包括编辑效率不高、脱靶效应明显、筛选周期长等。针对这些问题，以下策略可供参考：

**1.**基于算法的gRNA个性化设计：结合目标细胞基因组特征进行多维度打分筛选。

**2.**不同细胞系参数调整：根据类型优化转染方式、Cas9活性水平等关键条件。

**3.**Cell Pool编辑效率快速评估：通过高灵敏度检测手段确认初步编辑效果。

**4.**提升克隆形成率：优化培养体系，提升单克隆扩增效率。

**5.**微量细胞高通量鉴定技术：大幅缩短筛选周期，提高阳性克隆筛查效率。

**敲除细胞的核心应用场景****1.**基础科学研究

敲除关键基因（如TP53）研究其在癌症发生中的作用；

配合CRISPR文库筛选，开展全基因组功能研究。

**2.**疾病模型构建

敲除APP等基因，建立神经退行性疾病模型；

利用患者来源的iPSC模拟遗传病，为个性化医疗提供依据。

**3.**药物靶点验证与新药筛选

敲除候选靶点，评估其对疾病相关通路的影响；

构建耐药细胞模型，研究抗药机制，助力药物开发。

**4.**农业与生态研究

敲除作物感病基因，提升抗病能力；

用于环境保护相关的基因调控研究。

总结敲除细胞系作为揭示基因功能、验证疾病机制和开发创新疗法的重要手段，正借助CRISPR等新兴技术，迈向更高通量、更精准、更自动化的发展阶段。掌握前沿策略与方法，将显著提升科研效率，为生命科学探索提供坚实支撑。