精准点突变细胞系构建：从原理到实操四大策略全解析_风闻

在高通量测序（NGS）日趋普及的当下，大量人类单核苷酸多态性（SNP）被发现与多种疾病密切相关。为了揭示这些SNP在病理过程中的具体作用，研究者越来越多地依赖于具有特定位点突变的细胞模型作为功能研究和机制探索的重要工具。尽管相关构建技术已经取得长足进展，但点突变模型的建立依然面临效率不稳定、难度高等挑战。为此，小编整合基因编辑领域多年技术积淀，推出四种主流解决方案，满足多样化科研需求。

一、RNP法：灵活高效的主流编辑方案

适用范围：常见贴壁细胞、标准SNP替换建模

技术核心**：**

该方法将体外合成的gRNA与Cas9蛋白预先组装为RNP复合物，并与单链寡核苷酸（ssODN）作为供体模板共转染至目标细胞。Cas9在识别切割目标DNA后，细胞通过同源定向修复（HDR）机制引入指定碱基变化。

操作流程概览：

精准设计gRNA（靶点±20 bp）

合成带突变信息的ssODN（长度约120–150nt）

共转染RNP + ssODN（电转或脂质体法）

PCR筛选 + Sanger测序确认

技术优势：

不依赖DNA质粒，表达短暂，降低脱靶风险

操作流程简洁，适应性强

成本相对较低，适合中高通量构建

潜在限制：

RNA本身不稳定，对实验操作要求较高

需依赖高效gRNA设计，部分位点成功率受限

不适用于低HDR效率或难转染细胞类型

二、Prime Editing：突破性精确编辑工具

适用范围：复杂碱基替换、小片段插入或缺失

技术原理：

Prime Editing采用融合了Cas9-nickase与逆转录酶的Prime Editor酶体系，并配合含有编辑模板的pegRNA。系统无需DNA双链断裂或供体DNA模板，即可将特定突变“写入”基因组中。

操作流程概览：

设计pegRNA（含引导区、RT模板与PBS）

质粒共转染Prime Editor + pegRNA

选用适当转染手段（如电转、脂质体）

测序确认编辑成功

技术优势：

可实现多类型点突变（包括非转换类）

极低脱靶率，indel风险显著下降

在突变功能验证等高精度研究中优势明显

潜在限制：

pegRNA设计复杂，实验优化周期长

整体编辑效率仍有提升空间

细胞系依赖性强，部分类型不适配

三、Base Editing：无需断裂的高效碱基替换工具

适用范围：已知可转换碱基突变（C>T、A>G等）

技术原理Base Editor由特定脱氨酶（如APOBEC或TadA）与Cas9-nickase融合构成，在目标位点实现碱基“转化”而非“切换”，规避DNA双链断裂及HDR依赖。

CBE系统实现 C→T 或 G→A

ABE系统实现 A→G 或 T→C

操作流程概览：

精准设计gRNA，使突变位于编辑窗口

转染编辑系统（质粒或病毒载体）

PCR + 测序筛选阳性克隆

技术优势：

效率极高，且细胞毒性较低

编辑安全性好，适合用于敏感突变研究

已在多种细胞与生物模型中验证成熟

潜在限制：

仅适用于特定类型的碱基转换

编辑窗口有限，易出现“旁观突变”

多个目标碱基并存时难以精准控制

四、质粒抗性筛选法：解决复杂突变建模难题

适用范围：特殊位点、低HDR细胞或gRNA难设计区域

技术原理：

通过共转染表达Cas9/gRNA的质粒与带有抗性筛选盒和长同源臂的供体质粒，利用HDR机制完成精准插入。筛选盒嵌于内含子区，由LoxP位点包裹，可后期通过Cre酶切除。

操作流程概览：

设计内含子靶点gRNA与600–1000 bp同源臂

转染Cas9/gRNA + Donor质粒

抗生素筛选阳性细胞，使用Cre去除抗性盒

PCR + 测序验证

技术优势：

筛选效率高，适用于HDR效率低的细胞系

不依赖PAM附近的精准设计，适配范围广

可用于构建复杂或低频率点突变模型

潜在限制：

实验周期较长，操作流程繁复

抗性盒移除后LoxP残留，存在“编辑痕迹”

对不耐抗生素的细胞系不适用

总结

精准**点突变****细胞系**的构建策略因实验目的、突变类型与细胞特性而异。RNP法因其简洁与灵活性成为首选，Prime Editing与Base Editing则在精密控制与特定突变类型中展示强大潜力，而质粒抗性筛选则为复杂构建任务提供了强有力的支持。选择合适方案，将显著提升突变模型的构建效率与实验可重复性。