GSTP1介导的Pik3r1的S-谷胱甘肽化调控破骨细胞形成_风闻

骨质疏松症是一种与年龄有关的代谢疾病，与骨密度有直接关系，GSTP1是一种谷胱甘肽S-转移酶P1，其在多种疾病中的治疗潜力已被发现。该研究通过孟德尔随机化遗传关联及单细胞测序分析发现GSTP1可能与骨密度存在一定的关联性。通过氧化还原质谱、免疫共沉淀、非变性非还原免疫印迹、流式细胞术、质谱分析、CRISPR-CAS9基因编辑等关键实验探究GSTP1对骨密度影响的具体机制，发现GSTP1可以通过Pik3r1的Cys498和Cys670上调S-谷胱甘肽化水平，从而抑制其磷酸化，进而通过Pik3r1-AKT-mTOR轴调控自噬通量的变化，影响体外破骨细胞的分化，最后在体外调控破骨细胞的形成。

浙江大学附属医院骨科研究中心严世贵课题组在氧化还原领域权威期刊，中科院一区TOP杂志《REDOX BIOLOGY》上发表了题为“GSTP1-mediated S-glutathionylation of Pik3r1 is a redox hub that inhibits osteoclastogenesis through regulating autophagic flux”（IF2022:10.787）。

该研究首先通过孟德尔随机化分析以证明 MDS与骨矿物质密度(BMD)之间存在的的潜在因果联系。总结了已经报道的MDS信号转导蛋白和可能作用的靶位，发现GSTP1可能影响BMD，利用RT-qPCR检测成骨细胞特异性基因RUNX2的表达量、敲低或过表达GSTP1发现GSTP1与成骨细胞分化关系不大，结合骨髓单细胞分析和Western Blot发现GSTP1在骨髓单核细胞中高度表达，且在老年女性和年轻女性中出现差异，发现GSTP1对BMD的影响更可能通过破骨细胞发生。

自噬对破骨细胞分化有广泛的影响，本文从自噬角度继续探究GSTP1如何影响破骨细胞。细胞经rGSTP1刺激后出现了更多的自噬囊泡和吞噬囊泡，选择哺乳动物自噬蛋白LC3的作为自噬通量标记物，作者通过比率流式法和自噬双标慢病毒检测过表达或敲低GSTP1时不同细胞系在破骨细胞形成过程中的自噬通量改变。而自噬激活剂雷帕霉素通过激活自噬通量逆转了低水平GSTP1促进的破骨细胞形成。上述结果证明GSTP1可以通过调节破骨细胞分化过程中的自噬通量来调节破骨细胞的发生。

雷帕霉素以mTOR为靶点，mTOR参与哺乳动物自噬主要通过ERK或PI3K-AKT通路激活，为了确定GSTP1在破骨细胞分化过程中对自噬的调控是否通过mTOR完成，刺激下分化 5天BMMs，在磷酸化水平上与对照组没有差异，利用敲低和转染，探究GSTP1和磷酸化 Pik3r1、AKT水平之间的关系，结果表明GSTP1调控的自噬通量是通过Pik3r1-AKT-mTOR信号级联来完成的。

进一步验证GSTP1下游激酶活性的调控是否与S-谷胱甘肽有关，作者探索了Pik3r1更微观的蛋白质分子结构，首先，不同物种的初步序列比对显示Pik3r1中的4个半胱氨酸（Cys498，Cys656，Cys659，Cys670）在进化上是保守的，表明半胱氨酸残基在Pik3r1功能的调控中发挥着重要作用。免疫共沉淀结果显示过表达和敲低GSTP1在破骨细胞形成过程中改变了Pik3r1的S-谷胱甘肽化水平，进而下调了Pik3r1作为激酶的磷酸化水平。

接着，通过非还原非变性免疫共沉淀以及氧化还原相关修饰质谱坚定到Cys498和Cys670可以发生S-谷胱甘肽化。此外，分子蛋白对接的结果也表明，Cys498和Cys670更容易与GSH发生相互作用。二维图像清楚地显示谷胱甘肽与蛋白质Pik3r1-CYS498共价对接后，谷胱甘肽与GLN499和GLU502形成氢键，与LYS532和GLU502发生静电相互作用；同样地，Pik3r1-CYS670与配体GSH对接的二维图谱显示，小分子GSH与HIS669、HIS668、ARG649、VAL671形成氢键，与ARG649存在静电相互作用。

综上，作者确定了Cys498和Cys670是Pik3r1发生S-谷胱甘肽化的两个半胱氨酸残基位点。

为了阐明GSTP1介导的Pik3r1的S-谷胱甘肽化在破骨细胞生成中的作用，作者先用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除RAW264.7细胞中的Pik3r1，排除内源Pik3r的影响，然后用丙氨酸替代其中可能发生S-谷胱甘肽化半胱氨酸位点，构建了3个单位点突变质粒和1个双位点突变质粒。最后，将这些突变质粒和野生型myc-Pik3r1质粒转染到Pik3r1-KO的RAW细胞中完成后续实验。源井基因编辑提供了CRISPR/CAS9基因编辑技术，成功构建了Pik3r1的敲除RAW264.7细胞系（如下图），为后续的突变回补验证奠定了重要基石。

​补充图11：

图 7  GSTP1 介导的 Pik3r1 的S-谷胱甘肽化调节破骨细胞生成

在破骨细胞形成过程中，共免疫沉淀的结果表明，在转染了C498A和C670A 突变质粒的细胞中，GSTP1介导的Pik3r1 S-谷胱甘肽化水平低于转染了野生型质粒的细胞。但在转染了C656A突变质粒转染的细胞中Pik3r1的S-谷胱甘肽化水平没有显著差异。此外，作者同时突变Cys498和Cys670，并将双突变质粒转染到Pik3r1-KO的Raw264.7细胞中。在相同条件下，免疫共沉淀结果显示GSTP1介导的S-谷胱甘肽化水平被完全消除（图7F），这有力地证明了破骨细胞生成过程中GSTP1介导的Pik3r1的S-谷胱甘肽化是通过Cys498和Cys670实现的。

至此，作者通过详尽的体外实验证明Cys498和Cys670是GSTP1介导的Pik3r1发生S-谷胱甘肽化的两个半胱氨酸位点，并且这种氧化还原相关的修饰可以通过Pik3r1-AKT-mTOR级联通路调节自噬通量并最终抑制破骨细胞生成。

该研究通过大量的体内外实验探索了GSTP1重塑破骨细胞相关骨稳态的一种全新机制，第一次诠释了破骨细胞的细胞命运是由GSTP1介导的氧化还原相关的翻译后修饰-自噬流级联轴来决定的。