一种激活内源杀伤性CD8+ T细胞的白癜风小鼠模型的建立方法_风闻

白癜风是一种较为常见的皮肤自身免疫病，这种疾病可能导致全身性或局部皮肤、毛发或黏膜的脱色。白癜风的全球发病率约在0.5%~2%之间，目前我国有超过1千万患者。白癜风严重影响了患者的容貌，绝大多数病人认为白癜风给他们带来了极大的心理伤害，严重影响了他们的社交和生活。

白癜风的关键特征是自体识别性CD8+ T细胞攻击导致的黑色素细胞死亡，进而出现表皮白斑，病程较长的病人会出现毛发脱色现象。不少研究都表明，白癜风病人体内同时存在着多种针对黑色素细胞相关抗原（包括MelanA、TYR、gp100等）的自体识别性CD8+杀伤性T细胞。

白癜风的发病诱因多样，机制不清，因此治疗较为困难。目前，不管是传统的紫外光疗或激素疗法，还是新型小分子抑制剂或抗体药物疗法，都不能够产生稳定优良的治疗效果，复发概率极大。因此，需要进一步探究白癜风疾病的致病和病理进程的机制，找到新的治疗靶点，以开发出更加高效、便捷的新型治疗方法。而为了达到这一目的，一个好的白癜风动物模型是必不可少的。

早期的白癜风模型如Smyth鸡、辛克莱猪等，不适用于大规模实验，且没有适用的遗传工具能够利用这些模型研究白癜风的机制。皮肤表面涂抹莫诺苯宗等化学试剂可以诱导小鼠毛发脱色，但这种脱色来源于脱色剂对黑色素细胞的直接破坏，不依赖于杀伤性T细胞。自发白癜风小鼠模型多为TCR转基因小鼠，这些小鼠的CD8+ T细胞携带识别特定黑色素细胞相关抗原的TCR，如FH小鼠（识别Tyr369-377），Pmel小鼠（识别gp10025-33）等，它们往往在成年后会自发产生毛发的脱色，并随年龄的增长而扩大。但单纯以毛发脱色作为白癜风发生的标准，与人类疾病不符。Harris等人还开发了一种过继转移Pmel T细胞的白癜风模型：对K14-SCF受体小鼠进行亚致死量辐照后，过继转移Pmel TCR转基因小鼠来源的CD8+ T细胞，继而用携带gp100抗原的牛痘病毒激活。这种模型可诱导小鼠出现表皮脱色，但只有一种针对黑色素细胞相关抗原的CD8+ T细胞参与，与白癜风病人中存在多种CD8+ T细胞的参与不符；这种方法需要TCR转基因小鼠和一种特殊的K14-SCF转基因小鼠，限制了用遗传学方法研究白癜风的机制；且牛痘病毒材料不易获得，实验操作复杂，并不适合推广。

近日，北京生命科学研究所／清华大学生物医学交叉研究院的陈婷课题组在Cell Regeneration上发表了题为“A mouse model of vitiligo based on endogenous auto-reactive CD8+ T cell targeting skin melanocyte”的方法论文章。文中报道了一种白癜风小鼠模型的建立方法，即在C57 BL/6背景小鼠中接种B16F10黑色素瘤细胞，接种的同时杀除Treg细胞，因黑色素瘤细胞和黑色素细胞存在共享抗原，这一操作激活了小鼠内源性的自体识别性CD8+杀伤性T细胞，从而杀伤表皮黑色素细胞，导致白癜风的发生。同时，文章介绍了如何使用流式细胞术及wholemount染色方法从细胞水平分析白癜风的发生和进展。此外，因成纤维细胞在白癜风疾病进展中的重要作用，文章也描述了一种体内shRNA介导的成纤维细胞特异性敲低方法。

这一白癜风模型的开发基于临床黑色素瘤免疫治疗上的发现。部分黑色素瘤患者在接受anti-PD1/PD-L1或anti-CTLA4等免疫检查点抑制的治疗后会自发发生白癜风。同时，研究表明白癜风患者体内的Treg细胞发生了功能上的失调。黑色素瘤／Treg诱导白癜风模型能够诱导小鼠出现表皮白斑及毛发脱色等典型的白癜风病征，同时也能够从细胞层面模拟人类白癜风疾病：诱导操作后33天即可观察到CD8+ T细胞的大量浸润以及表皮黑色素细胞的缺失。分子层面上，与白癜风患者类似，该模型中的表皮CD8+ T细胞同样高表达IFN-γ、Granzyme A、Granzyme B、Perforin、FasL等效应因子（Xu Z, et al., 2022）。

A. 黑色素瘤／Treg诱导的白癜风模型示意图

B. 白癜风小鼠背部毛发脱色和尾巴表皮白斑代表图

C. 白癜风小鼠尾巴表皮的wholemount染色及流式分析黑色素细胞和CD8+ T细胞的分布情况，Dct：多巴色素互变异构酶

这一模型实验周期短，分析方法简便，重复率高。同时，建立模型仅需简单的实验材料：B16F10黑色素瘤是常见的细胞系，anti-CD4是成熟的商业化抗体，小鼠也只需要C57 BL/6背景小鼠，不需要复杂的转基因小鼠，为深入机制研究提供了方法上的便利。利用该模型，陈婷实验室在前期的工作中发现，成纤维细胞响应IFN-γ，进一步招募杀伤性CD8+ T细胞，促进黑色素细胞的丢失（Xu Z, et al., 2022）。

白癜风的发病诱因很多，既有遗传倾向性，目前已有80余个易感性相关联的区域／基因报道；又有后天环境诱发因素，包括有害化学试剂的暴露、某些病毒的感染，以及黑色素瘤患者接受免疫抑制治疗等。故难以通过一个模型模拟所有诱发因素导致的白癜风。本文报道的黑色素瘤／Treg诱导的白癜风模型能够从外在表型、细胞层面、分子层面完全模拟人类白癜风的疾病特征，适用于更深入的白癜风机制探究和新药开发。但值得一提的是，这一模型早期会短暂地去除CD4+ T细胞，因此不适用于研究CD4+ T细胞在白癜风疾病发生和进展中的作用。

Reference：

Xu Z, Chen D, Hu Y, Jiang K, Huang H, Du Y, Wu W, Wang J, Sui J, Wang W, et al. Anatomically distinct fibroblast subsets determine skin autoimmune patterns. Nature. 2022; 601:118–24.

Cite this article：

Chen, D., Xu, Z., Cui, J. et al. A mouse model of vitiligo based on endogenous auto-reactive CD8 + T cell targeting skin melanocyte. Cell Regen 11, 31 (2022). https://doi.org/10.1186/s13619-022-00132-9