Cancer Res：揭示高级别浆液性卵巢癌的分子调控机制_风闻

卵巢癌是致死率最高的妇科肿瘤之一，其中高级别浆液性卵巢癌（High-grade serous cancer，HGSC）是最常见的亚型。高级别浆液性卵巢癌通常在确诊时已是晚期，并且常伴随广泛的盆腹腔转移甚至远端转移。尽管对手术和化疗有初步的临床反应，但大多数患者均会在五年内复发。因此，了解高级别浆液性卵巢癌发生发展的分子机制具有重要的临床意义。

肿瘤内异质性是阻碍高级别浆液性卵巢癌研究最大的障碍之一。单细胞组学测序为研究肿瘤内异质性提供了强有力的工具，此前已有一些研究利用单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）揭示了高级别浆液性卵巢癌内高度的肿瘤内异质性，但其发生发展过程中的基因组和表观基因组的变化还有待于进一步研究。

为了全面揭示高级别浆液性卵巢癌在发生发展过程中不同组学层面的分子特征及其互作关系，北京大学生物医学前沿创新中心汤富酬课题组与北京大学人民医院崔恒课题组、清华大学纪家葵课题组合作，对12例高级别浆液性卵巢癌患者、4例非浆液性卵巢癌患者及6例输卵管组织正常对照进行了高精度单细胞多组学测序分析（基因组（拷贝数变异）、染色质状态组、DNA甲基化组、转录组。

相关研究成果近日以：Single-cell dissection of the multiomic landscape of high-grade serous ovarian cancer 为题在线发表在 Cancer Research 期刊上。

图1.研究策略示意图

该研究的主要发现有：1.揭示了高级别浆液性卵巢癌肿瘤发生过程中氧化磷酸化通路和糖酵解通路的活性同时增强。肿瘤组织由多种类型的细胞组成，准确鉴定细胞身份是肿瘤研究中的重要环节。此前大多数基于单细胞转录组单组学的研究主要是利用细胞类型特异性标志物的基因表达以及由RNA表达间接推断的基因组拷贝数变异（SCNA）来区分恶性细胞（癌细胞，肿瘤细胞）和非恶性细胞（非癌细胞，非肿瘤细胞）。利用单细胞多组学测序技术，除了可以利用转录组的信息，还可以利用基因组DNA的信息直接推断基因组拷贝数变异，更准确地反映拷贝数变异的情况。结果显示，存在一些由RNA间接推断有基因组拷贝数变异的细胞实际上不含有基因组拷贝数变异（假阳性），也存在一些由RNA间接推断没有基因组拷贝数变异的细胞实际上含有少量的基因组拷贝数变异（假阴性），这突显了应用单细胞多组学技术的必要性。通过比较输卵管上皮细胞（FTE）与原发位肿瘤细胞之间的基因表达差异，该研究发现，与真核转录和蛋白质泛素化相关的通路在高级别浆液性卵巢癌肿瘤细胞中显著下调，提示在高级别浆液性卵巢癌的肿瘤发生过程中蛋白质翻译和降解等方面发生了剧烈变化。另外，有361个基因的表达在肿瘤细胞中特异性上调，它们主要富集在VEGFA-VEGFR2信号通路、金属离子稳态、病毒相关过程调控和代谢调控等通路上。值得注意的是，对细胞能量代谢至关重要的氧化磷酸化（OXPHOS）通路和糖酵解通路同时发生上调。为了进一步探究这一现象是否是由于存在两种不同亚型的肿瘤细胞 （一种亚型肿瘤细胞中上调氧化磷酸化通路，而另一种亚型肿瘤细胞中上调糖酵解通路），该研究计算了每个单细胞的氧化磷酸化评分和糖酵解评分。结果显示正常输卵管上皮和高级别浆液性卵巢癌细胞可以被明确区分，而肿瘤细胞无法进一步划分为不同的亚型，且不同患者之间存在微小的差异，这说明肿瘤细胞中同时增强了氧化磷酸化通路和糖酵解通路的活性（图2）。为了进一步明确高级别浆液性卵巢癌的典型特征，该研究还将高级别浆液性卵巢癌与非浆液性卵巢癌中的肿瘤细胞进行了系统比较。通过主成分分析（PCA）发现，高级别浆液性卵巢癌的肿瘤细胞与非浆液性卵巢癌的肿瘤细胞的基因表达差异非常突出，表明高级别浆液性卵巢癌具有独特的基因表达特征。此外，差异基因表达分析显示，与非浆液性卵巢癌相比，高级别浆液性卵巢癌的肿瘤细胞中金属硫蛋白基因和干扰素（IFN）信号通路相关基因的表达也更高。这说明干扰素信号通路的强烈上调是高级别浆液性卵巢癌的突出特征。

图2. 代谢相关通路的打分及ISG15的免疫组化2. 确认了高级别浆液性卵巢癌肿瘤发生过程中8号染色体拷贝数增加导致MYC基因剂量增加进而导致氧化磷酸化通路和糖酵解通路活性增强。高级别浆液性卵巢癌细胞中8号染色体经常发生拷贝数增加，因此该研究分析了肿瘤细胞中特异性上调的基因（361个）是否与8号染色体的扩增有关。结果表明，肿瘤细胞特异性上调的361个基因中有46个位于8号染色体上，8号染色体是肿瘤上调基因最富集的染色体。这46个基因主要富集在电子传递链和氧化磷酸化相关的通路上。进一步的研究发现这46个基因的上调与患者更短的总生存期密切相关。此外，该研究还观察到调控细胞分裂、氧化磷酸化和糖酵解的MYC（位于8号染色体上）在12例高级别浆液性卵巢癌患者中有10例发生上调。结果提示，8号染色体的扩增可能通过增加原癌基因MYC以及OXPHOS相关基因的剂量来促进高级别浆液性卵巢癌的肿瘤发生。3.探究了高级别浆液性卵巢癌肿瘤发生过程中DNA甲基化对基因表达的调控作用。DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰之一，在肿瘤发生过程中经历广泛的重编程，并可能影响基因表达。该研究分析了重复元件区域甲基化、基因启动子区域甲基化和远端调控元件区域甲基化对基因表达的潜在调控作用。该研究发现绝大部分卵巢癌患者（9/11）的肿瘤细胞的基因组甲基化水平都显著降低，这表明大规模DNA去甲基化也是卵巢癌的显著特征。对所有患者而言（11/11），卫星核元件（satellite DNA）和长散在核元件1 （LINE1）均表现出最显著的DNA去甲基化。相关性分析显示，可能同时受satellite DNA和LINE1负调控的基因主要富集在金属硫蛋白结合金属、干扰素、凋亡、血管生成相关通路；可能受其正调控的基因主要富集在核糖体合成相关通路。进一步分析受启动子甲基化调控的基因，发现金属硫蛋白结合金属相关基因以及干扰素通路相关基因很可能也同样受其启动子甲基化改变的影响。该研究利用MICMIC分析了远端调控元件（例如：增强子）的甲基化对基因表达影响。该研究共检测到16,941对调控区域-靶基因对。其中53.9%与靶基因的表达呈负相关关系。大多数靶基因可能受DNA甲基化调控的调控区域个数小于5个。上述结果表明，有些基因不仅可能受其启动子区域甲基化的调控，还可能受其远端调控区域甲基化的调控。例如，肿瘤细胞特异性上调的基因IFI27（图3）的表达与其启动子DNA甲基化负相关，也与其远端调控元件（距离IFI27转录起始位点约235kb）甲基化负相关。此外，该远端调控元件区域与一个已知的增强子区域重叠，其侧翼区域在原发位肿瘤细胞中比输卵管上皮细胞表现出更高的染色质开放性，突出了其对IFI27表达的潜在调控作用。

图3. 示意图显示远端区域（WCG7649168: chr14: 94,577,079-94,583,033）的甲基化可能调控IFI27的表达4.发现在高级别浆液性卵巢癌肿瘤发生过程中FOXK1、TFAP2C、NR2F6、DDIT3等重要转录因子的调控活性显著增强。转录因子蛋白与基因顺式调控元件的特异性结合是转录调控的基本机制，而转录因子的结合通常受染色质状态的调控。该研究发现肿瘤细胞的全局染色质状态比输卵管上皮细胞更开放，而基因启动子区域（转录起始位点邻近区域）的染色质开放程度却比输卵管上皮细胞更低（开放区域更窄、开放幅度更低）。为了探索高级别浆液性卵巢癌肿瘤发生过程中潜在的关键调控因子，该研究使用chromVAR对NDR进行转录因子结合基序（binding motif）富集分析。总共有107个转录因子的基序在肿瘤细胞中更开放，而另外126个转录因子的基序则更封闭。为了进一步探究哪些转录因子更可能参与到肿瘤特异性的基因表达调控中，该研究使用Lisa推断调控肿瘤特异性表达基因的转录因子。在这107个转录因子中，FOXK1、TFAP2C、NR2F6、DDIT3这4个转录因子本身的表达水平在肿瘤细胞中显著高于输卵管上皮细胞（图4）。FOXK1是诱导糖酵解的重要调控因子，考虑到糖酵解途径在高级别浆液性卵巢癌中表达上调，并且其转录调控因子FOXK1的结合基序显示出较高的可及性，该研究认为FOXK1很可能是高级别浆液性卵巢癌的候选治疗靶点。图4. 利用染色质可及性和转录组信息综合探究高级别浆液性卵巢癌中可能起重要调控作用的转录因子5. 发现高级别浆液性卵巢癌在腹腔转移过程中肿瘤细胞的基因表达模式基本不变。在准确鉴定出肿瘤细胞后，该研究利用染色体内的断点信息构建了同一个患者体内肿瘤细胞的不同遗传谱系。尽管高级别浆液性卵巢癌携带有大量的基因组拷贝数变异，它们的遗传谱系组成却相对简单，大多数患者（8/9）的肿瘤细胞只有1-2个遗传谱系。在分析了输卵管上皮细胞与高级别浆液性卵巢癌的原发位肿瘤细胞之间的差异后，该研究接下来探究了同一个遗传谱系的原发位肿瘤细胞与转移位肿瘤细胞之间的基因表达差异。结果显示，在大多数患者中（5/6），同一个遗传谱系的肿瘤细胞在转移到腹腔后只有极少数基因的表达发生了改变（但是在转移到淋巴结的一例患者中，同一个遗传谱系的肿瘤细胞在转移前后有两千多个基因的表达发生了显著改变；图5）。这表明，虽然肿瘤细胞已经转移到腹腔，但腹腔的微环境并不会强烈影响肿瘤细胞的整体基因表达模式，并提示肿瘤细胞转移到腹腔的能力很可能是在肿瘤发生的早期阶段获得的。虽然腹腔转移位肿瘤和原发位肿瘤之间只有少数几个基因是有表达差异的，但这些差异表达基因为发现促进腹腔转移的关键基因提供了线索。该研究验证了在高级别浆液性卵巢癌转移过程中HSPA6基因的特异性下调的作用。结果显示，过量表达HSPA6可抑制癌细胞的迁移和侵袭，提示HSPA6的特异性下调促进了高级别浆液性卵巢癌的肿瘤转移过程（图5）。

图5. 原发位肿瘤和转移位肿瘤间的差异基因及HSPA6的功能验证6.发现高级别浆液性卵巢癌在腹腔转移过程中肿瘤细胞的DNA甲基化模式基本不变。该研究发现，在大多数高级别浆液性卵巢癌患者的肿瘤转移过程中，肿瘤细胞的全局DNA甲基化水平基本维持不变（图6）。因此，可以利用DNA甲基化模式来推断同一个患者体内肿瘤细胞的遗传谱系。对DNA甲基化进行的无监督分层聚类验证了这一点，结果显示基于DNA甲基化模式推测出了与基于基因组拷贝数变异一致的肿瘤细胞遗传谱系（图6）。

图6. 癌细胞在转移过程中保持DNA甲基化水平和模式7.发现可以利用原发位肿瘤内不同谱系肿瘤细胞之间的基因表达差异寻找参与肿瘤转移的候选基因。肿瘤细胞遗传谱系的重建可以揭示肿瘤内异质性并提供更加精确的肿瘤转移分析。原发位肿瘤里不同遗传谱系的肿瘤细胞不仅具有不同的基因组拷贝数变异、不同的DNA甲基化水平和不同的基因表达模式，而且很可能也具有不同的转移潜力。例如， OC09患者和OC14患者均有两个不同的肿瘤细胞遗传谱系（谱系A1和A2）。谱系A1的肿瘤细胞发生了转移，而谱系A2的肿瘤细胞却没有发生转移。差异基因表达分析显示，OC09患者和OC14患者的A1谱系肿瘤细胞相比于A2谱系，均特异性上调了CCN1和HSP90AA1的表达（图7）。利用CRISPR-Cas9系统敲除CCN1基因后，卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力均显著降低。使用HSP90α抑制剂TAS-116特异性抑制HSP90AA1活性后，卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力都显著降低（图7）。上述结果表明，CCN1和HSP90AA1很可能参与了高级别浆液性卵巢癌的肿瘤转移过程，并可能作为卵巢癌的潜在治疗靶点。

图7. CCN1和HSP90AA1的功能验证综上，该研究首次以单细胞和单碱基分辨率系统性地探索了高级别浆液性卵巢癌中基因组拷贝数变异、DNA甲基化组、染色质状态组以及转录组等不同组学层面的分子特征。综合分析了高级别浆液性卵巢癌的分子变化规律，发现了CCN1、HSP90AA1等潜在治疗靶点，有助于更深入地理解该疾病的分子特征，为该疾病的诊断和治疗提供理论依据。论文链接：https://aacrjournals.org/cancerres/article/doi/10.1158/0008-5472.CAN-21-3819/707741/Single-cell-dissection-of-the-multiomic-landscape