交配可以启动稳定的 RNA 沉默,克服表观遗传恢复 2_风闻
观察员2号-2021-07-12 09:43
我们检查了与iT相关的沉默信号在其他基因组位置的序列的潜在传播。基因编码分享序列同一性,但不是基因仅内含子或蛋白序列同一性,进行种系通过内沉默智达在反(图 4克和补充图 7D)。反式沉默只能在稳定建立的iT下检测到,但不能与交配诱导的T沉默同时检测到(补充图 7e),表明交配诱导的沉默的启动和维持在数量上是不同的(例如,小 RNA 的数量不同)或在质量上是不同的(例如,小 RNA 产生的时间不同或小 RNA 的不同性质)。与同源依赖的反式沉默一致,在从T 中删除gfp后通过交配诱导的沉默建立的iTΔ不会使其他gfp基因在反式中沉默(补充图 7f)。在所有情况下,沉默(反式或通过可分离的沉默信号)仅限于生殖系。此外,沉默信号的母本而非父本传递影响同源基因的表达(补充图 7g)。在功效和/或沉默信号的传输这种差异可能反映了两个配子和/或差异的性质或水平沉默通过两个配子继承信号的在细胞内环境的差异17,46。
基因可以从沉默中恢复并对反式沉默产生抗性当祖先暴露于神经元双链 RNA (dsRNA) 导致 > 25 代沉默47时,先前观察到T对 TEI 的敏感性。为了探索改变T表达的变化是否总是导致永久沉默,我们使用反式沉默作为启动沉默的替代方法,并检查了基因表达在种系中恢复的频率。的相互作用Ť与智达导致强反式的沉默Ť如预期也从后代表达的弱激活智达(补充图 7H)。这种重新激活可以通过与沉默信号相反的保护性信号的活动介导(补充图 7i),导致一小部分iT动物的后代在每一代中都表现出表达(补充图 7h)。然而,iT对Tcherry和TcherryΔpi的反式沉默效应(图 5a和补充图 7j,k)不太稳健。即使在具有纯合子Tcherry和TcherryΔpi 的后代中没有iT的情况下,一代暴露于iT也会导致沉默,但在几代之内就恢复了表达。大约 60% 的Tcherry动物和几乎 100% 的TcherryΔpi动物在七代内恢复(图 5a)。有趣的是,尽管沉默的iT持续存在,但TcherryΔpi变得对反式沉默具有抗性(比较图 5a 中的iT/Tcherry与iT/TcherryΔpi)。缺乏核定位的 GFP 和 mCherry 表明iT的持续沉默。这些观察结果表明piRNAs与目标转录物(Tcherry)结合或与iT完全同源促进其对由iT制成的小 RNA 的反式沉默的持续敏感性。由于在种系内表达的内源基因被认为具有“许可”特征,可以对抗 piRNA 的沉默(例如,PATC 序列14,CSR-1 靶向24),我们检查了用gfp标记的内源基因的反式沉默。该PGL-1 :: GFP基因表现出从完全的开关反沉默由智达在第一代到检测不到的沉默两代内(图 5b中)。这些结果为与稳定沉默相关的 RNA 提供了两个令人惊讶的见解:(1) 即使在这些基因成功沉默几代之后,它们也不足以诱导同源基因的稳定沉默;(2) 尽管最初是沉默的,但它们的活性可能会被来自最近活跃的同源基因的信号所抵消。
图 5:在生殖系内的反式沉默之后,可以在几代内恢复基因表达和对后续沉默的抗性。
a Tcherry或TcherryΔpi动物与稳定沉默超过 150 代的iT交配,并在产生的杂交后代 (F1) 及其后代 (F2 到≤F8) 中对具有明亮Tcherry或TcherryΔpi表达的动物分数进行评分。误差线表示 95% 的置信区间。所用转基因的示意图显示在图表上方。参见补充图 7j,k,了解在每一代中为每个基因型和谱系分析的动物数量。绘制了明亮动物的分数,误差线表示 95% CI。b pgl-1::gfp动物与非转基因或iT交配动物和 PGL-1::GFP 的荧光在交叉后代(左)中量化或在交叉后代及其后代(中和右)中如图1c中所示评分 。显示了带有隐性dpy标记(蓝色字体)的染色体和评分的动物数量 ( n )。另见补充图 7。星号表示P <0.05使用双尾Student氏吨-test(B,左)或χ**2检验(b,右)。源数据作为源数据文件提供。
全尺寸图片dsRNA 沉默的持续性取决于目标基因的调控环境几项研究报告了不同条件下的 TEI,但研究之间的差异排除了对 TEI 易感性的一致解释(补充表 1)。因此,我们同时使用相同的实验条件喂养 RNAi 48来靶向相同的gfp序列,这些序列作为亲本动物中低或单拷贝种系基因的一部分表达,并检查了它们未经处理的后代 (F1-F5) 的沉默。因为亲本dsRNA可以存入子代15,16,仅该沉默超出F2代仍然存在可以明确地认为是跨代。在测试的 6 个靶基因中,有两个基因在 F2 后代中表现出沉默,但只有T显示超过 F2 的沉默(图 6a和补充图 8a-f)。因此,即使针对在不同监管环境下在同一组织内表达的相同编码序列,跨代沉默也是可变的。即使对于T,虽然可以在无偏繁殖时保持沉默,但一些动物可以从后代的沉默中恢复(图 6b)。类似于从反式沉默中恢复(图 5),尽管在父母中沉默了,后代仍表现出恢复(图 6a)。持续 RNA 沉默与从 RNA 沉默中恢复的原因不能仅仅归因于 HRDE-1 40因为尽管依赖 HRDE-1,但所有靶基因的沉默都不稳定(补充图 8g)。我们研究了通过 dsRNA 增强沉默是否可以克服恢复以增加 TEI 的持续时间。去除显示出对抗沉默的三种蛋白质,内切核酸酶 ERI-1 49、HERI-1 44或 MET-2 50,增强了沉默的持久性(图 6c、d和补充图 8h),尽管程度要小得多比之前报道的其他靶基因44、50。因此,T 它的变体是具有罕见调控背景的基因,这些基因使编码序列能够克服恢复并保留多代表达的变化。
图 6:父母中被 dsRNA 沉默的基因通常从后代的沉默中恢复。
a含有相同gfp序列的六个靶基因暴露于相同来源的对照 RNAi 或gfp RNAi。P0 动物被喂食 dsRNA 24 小时,并分析了 P0 动物及其最多五代(F1-F5)未经处理的后代。代表性图像突出了 P0 动物的生殖系(绿色轮廓)。指示了显示沉默的后代的数量。请注意,sun-1::gfp**var也存在于具有PH::gfp的动物中,但并未沉默,因为其gfp**var序列与用于喂养 RNAi的gfp -dsRNA仅具有 <14-nt 的连续同源性。比例尺表示 50 µm。乙表达T 的P0 动物暴露于对照 RNAi(P0 对照 RNAi)或gfp-dsRNA(P0 gfp RNAi)24 小时,并在 P0 动物及其未处理的后代中分析沉默。在gfp RNAi 中,P0 和 F1 动物都被汇集在一起进行成像,但每个从一个 P0 祖先(P0-1、P0-2 或 P0-3)下降的后代被成像为单独的分离物。显示的所有世代均通过成像评分,但 F2s 除外,其通过眼睛评分。虽然一个分离株显示了 TEI,但其他两个分离株恢复了表达(表观遗传恢复)。如示意图所示,gfp dsRNA的序列与gfp编码序列的外显子相匹配。c gtbp-1::gfp动物被喂食gfp -dsRNA(黑色)连续一、二或三代,并且它们在野生型(eri-1(+))或eri-1(-)背景中未经处理的后代(灰色)被评分为表达绿色荧光蛋白。d gtbp-1::gfp野生型(met-2(+)和heri-1(+))、met-2(-)或heri-1(-)背景中的gtbp-1::gfp雌雄同体被喂食gfp- dsRNA 24 小时和未处理的后代(F1-F7)的评分如补充图8c所示 。同时进行其他菌株的 RNAi 喂养,因此gtbp-1::gfp 的数据此处与补充图8c 中的相同 。在heri-1(-)动物中,P0 和 F1-F2 之间的统计差异是由于沉默增加,但 P0 和 F3-F7 之间的统计差异是由于沉默减少。大多数喂食对照 RNAi 和后代的动物都显示出明亮的 GFP 表达(除了 45 只 F5 后代中的 2 只和heri-1(-)动物的 37 只 F7 后代中的 1只显示暗淡表达)。指出了评分的动物数量 ( n )。星号表示 使用χ**2检验P < 0.05 。另见补充图 8。源数据作为源数据文件提供。
全尺寸图片总的来说,我们提出我们对诱导的 RNA 沉默反应的观察揭示了两种类型的调控环境,它们驱动了秀丽隐杆线虫种系内的表达(图 7):I 型容易受到响应瞬态扰动的永久性变化和 II 型要么抵抗扰动,要么可以在几代内恢复。需要额外的工作来发现区分 I 型基因和 II 型基因的特定调节分子及其排列。
图 7:模型描绘了两种具有不同跨代调控的基因。
I 型基因稳定表达重组序列(本研究中描述的T、Tcherry、Tgfp等),但在使用多种方法之一启动 RNA 沉默后仍可发生永久性遗传变化(左栏)。II 型基因稳定表达重组序列(本研究中描述的gtbp-1::gfp、mCherry::mex-5等)并显示 (1) 在交配诱导沉默时没有变化,(2) 显示沉默几代后,当受到 dsRNA 沉默时,表观遗传恢复,(3) 显示从沉默中恢复,然后在进行反式时产生抗性被另一个沉默的基因沉默。我们建议在 P0/F1 代期间对相同编码序列的调节器的不同招募可以解释永久性遗传变化与从变化中恢复的情况。
全尺寸图片讨论
交配诱导沉默的标志是:(1)沉默是在遗传后仅通过雄性精子开始的;(2)一旦开始,沉默是稳定的多代;(3)跨代沉默与DNA独立的沉默信号有关,该信号在每一代中产生,可以遗传一代,可以沉默同源序列;(4) 母体外显子序列可以阻止沉默的启动。虽然据我们所知,没有其他已知现象具有所有这些特征(补充表 2),但具有其中一些特征的现象(在补充讨论中详述)可以为未来的机械研究提供信息。
我们对双顺反子操纵子T及其衍生物的分析表明,竞争性母体信号在后代中建立基因表达。虽然母系遗传的 PRG-1 和 piRNA 介导了后代中父系遗传的T拷贝的交配诱导的沉默(图 2),但只要存在母系保护信号,沉默就会被反对(图 2f)。这种保护信号可以远离母体基因组发挥作用,尽管其身份目前尚不清楚,但有两个观察结果限制了可能性。一,来自T的部分mCherry编码区的母体存在可以保护mCherry和gfp表达(图 3)。 2e ),表明未剪接的前 mRNA 或 DNA 的序列依赖性识别作为杂交后代中的保护靶标。二,活性T继续容易受到交配诱导的沉默的影响,而不管前几代的保护或逃避沉默(补充图 5e,f),这表明交叉后代需要继承母体保护信号以在每一代中保持一致的基因表达.
这项工作表明,遗传杂交的方向可以强烈影响杂交后代的表型(图1))。此外,由于并非来自杂交的每个兄弟姐妹都具有相同的表型,因此选择用于进一步操作的兄弟姐妹可能会产生深远的影响。随后的跨代持续沉默可以使表型独立于基因型,从而导致错误的结论。因此,当使用遗传杂交产生品系时,需要控制遗传杂交的方向和选择用于繁殖的个体杂交后代的选择——尤其是在评估表观遗传现象时。例如,我们确保每次杂交都使用雌雄同体中存在的转基因进行,以避免在我们之前的研究中启动交配诱导的沉默,该研究检查了来自神经元47的 dsRNA 沉默。
交配诱导沉默的跨代稳定性甚至在数百代后仍具有恢复表达的潜力(图 3)表明这种机制在进化时间尺度上可能很重要。经受这种沉默的基因可以在针对其表达的选择中存活下来,并且由于改变表观遗传沉默的环境变化或沉默机制中的突变(例如在hrde-1中)而在后代中表达。因此,这种机制可以缓冲来自选择压力的有害基因,类似于分子伴侣如何缓冲来自选择压力的缺陷蛋白质51。秀丽隐杆线虫中的许多内源基因被 HRDE-1 22、40、52 , 53,其中一些可能是在具有该基因的雄性与没有该基因的雌雄同体交配时获得的。
使获得性变化永久化并加速适应性进化的机制的可能性令人相当兴奋10 , 54 , 55。我们使用 RNA 沉默作为诱导表观遗传变化的一个例子的分析表明,获得性变化的稳定性可能在大多数基因中受到限制,并且需要特定的调控环境来促进稳定的表观遗传变化。通过比较生殖系内表达的两种不同转基因,有人提出跨代沉默的持续时间取决于个体生物体56所采用的随机“状态” 。然而,检查具有不同调控背景的相同编码序列(图 6和补充图 2) 表明沉默的程度不是细胞或生物体水平的属性,而是基因水平的属性。事实上,同一组织内的不同基因对 RNA 沉默有不同的遗传要求(例如,bli-1沉默而不是dpy-7沉默需要核 Argonaute NRDE-3 57)。这需要对引起的变化的持续性额外监管环境是由酵母RNA介导的表观遗传变化的分析支持58,59,60。因此,稳定的表观遗传变化既需要一种复制或放大诱导变化的机制,也需要招募或激活这种机制的基因特异性调控环境。
方法概括
通过使用标准方法61产生和维持所有秀丽隐杆线虫菌株。菌株在 20°C 下生长,除了一些在prg-1(-)和mut-16(-) 中发生突变的菌株外,它们在 15°C 下生长(参见补充表 3以获得完整的菌株列表和补充所用寡核苷酸的表 4 )。在所有情况下,匹配对照杂交在与测试杂交相同的温度下进行。转基因T ( oxSi487) was introduced into mutant genetic backgrounds through genetic crosses using transgenic hermaphrodites and mutant males to avoid initiation of mating-induced silencing. In all crosses, transgenic genotypes are represented without repetition for simplicity (e.g. ‘T’, ‘Tcherry’ to refer to homozygous animals T/T, Tcherry/Tcherry, respectively). Genotypes represented as ‘+’ are non-transgenic animals with marker mutation(s) (+/+ in colored font) or wild-type animals (+/+ or +). Cross progeny from genetic crosses were identified by balancing or marking oxSi487 with recessive mutations in dpy-2(e8) unc-4(e120)、unc-4(e120)、dpy-2(e8)、unc-8(e49) dpy-20(e1282)和 CRISPR-Cas9 产生了dpy-10 的等位基因。在一些杂交中,通过使用 PCR对oxSi487转基因进行基因分型来鉴定杂交后代。在大多数情况下,使用 Cas9 蛋白和 sgRNAs 62进行基因组编辑(补充表 5)。使用 Nikon AZ100 显微镜在相同的非饱和条件下通过成像测量所有转基因菌株的沉默。使用 NIS Elements (Nikon) 和 ImageJ (NIH) 对图像进行量化。