基因编辑iPSCS敲除技术原理与潜在的治疗应用-源井生物_风闻

诱导多能干细胞（iPS细胞），是一种从成年（成熟）细胞生成的未成熟细胞，已经恢复了分化为体内任何类型细胞的能力。诱导的多能干细胞（iPS细胞）不同于胚胎干细胞（ES细胞），后者形成胚胎的内部细胞团，但也是多能的和原代细胞类似，最终导致构成人体的所有细胞类型。诱导多能细胞最早是在2006年由日本医师和研究员Shinya

Yamanaka及其同事描述的。最初的实验是通过使用小鼠细胞进行的。然而，第二年，Yamanaka成功地从人成年成纤维细胞中获得了iPS细胞。在此之前，只能从早期人类胚胎中分离出人类干细胞。因此，iPS细胞的一个重要特征是它们的产生不需要胚胎，而胚胎的使用充满了伦理问题。

使用CRISPR-Cas9对血友病患者自发iPSC中大因子VIII基因染色体倒置的功能校正

血友病A是由F8基因突变引起的X连锁遗传病，该基因编码凝血因子VIII。在所有严重的血友病A病例中，几乎有一半的病例是由两个总的（140 kbp或600 kbp）染色体倒置导致的，分别涉及F8基因的内含子1和22。研究人员从具有这些反转基因型的患者中衍生出诱导多能干细胞（iPSC），并使用CRISPR-Cas9核酸酶将这些染色体片段恢复为WT状态。研究人员基于全基因组测序或靶向深度测序，分离了频率高达6.7％的经反向校正的iPSC，而没有可检测到的脱靶突变。在其他致命的血友病小鼠模型中，从校正的iPSC分化出来的内皮细胞表达F8基因并在功能上拯救了VIII因子缺乏症。因此，结果为患者来源的iPSC中大染色体重排的功能校正提供了原理证明，并提出了潜在的治疗应用。

使用CRISPR-Cas9产生基因校正的自体iPSC来治疗遗传性视网膜变性

患者来源的诱导性多能干细胞（iPSC）对于自体细胞替代具有广阔的前景。但是，对于许多遗传性疾病，治疗可能需要在移植前进行基因修复。基因编辑技术对该应用程序很有用。这项研究的目的是开发CRISPR-Cas9介导的基因组编辑策略，以靶向和纠正患者衍生的iPSC中三种最常见的致病变体类型：（1）外显子，（2）深度内含子（3)主导功能。研究人员开发了针对雄性生殖细胞相关激酶（MAK）外显子9的纯合Alu插入的同源性定向修复策略，并证明了患者细胞中视网膜转录本和蛋白质的还原。研究人员产生了一种CRISPR-Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）方法，以切除导致Leber先天性黑病的主要因素，CEP290中的IVS26隐剪突变，并证明了患者iPSC中转录本和蛋白质的校正。最后，研究人员设计了等位基因特异性CRISPR向导，可选择性地靶向Pro23His视紫红质（RHO）突变体等位基因，在将其分别递送至患者iPSC和体内视网膜后，产生了移码和过早的终止，可阻止该疾病的转录-导致变体。在这项研究中开发的策略将被证明对纠正导致的遗传性视网膜变性基因中的多种遗传变异有用。

CRISPR-Cas9靶向破坏HLA基因以产生具有增强的免疫相容性的iPSC

诱导多能干细胞（iPSC）在再生医学应用中具有巨大潜力。然而，由HLA失配引起的免疫排斥是一个问题。

B2M基因敲除和HLA纯合iPSC群体可以解决此问题，但是前一种方法可能诱导NK细胞活性并且不能呈递抗原，而为后一种方法招募稀少的体则是一个挑战。研究人员展示了两种用于制备免疫相容性供体iPSC的基因组编辑策略。首先，研究人员通过对HLA杂合iPSC进行等位基因特异编辑，生成了HLA伪纯合iPSC。其次，研究人员破坏了HLA-A和-B等位的基因，以抑制NK细胞反应，同时保持抗原呈递，从而创建了具有HLA-C保留能力的iPSC。

HLA-C保留的IPSC可以在体内和体外逃逸T细胞和NK细胞。研究人员估计，结合HLA II类基因敲除的12种HLA-C保留的iPSC在免疫学上与世界90％以上的人口相容，极大地促进了基于iPSC的再生医学的应用。

Ubigene的目标是简化基因组编辑。我们已经开发了CRISPR-U™（基于CRISPR / Cas9技术），在双链断裂方面比普通CRISPR / Cas9更高效。 CRISPR-U™可以大大提高同源重组的效率，并在体内和体外轻松实现敲除（KO），点突变（PM）和敲入（KI）。借助CRISPR-U™，Ubigene已成功编辑了100多个细胞系上的基因。

Reference

Park C Y, Kim D H, Son J S, et al. Functional Correction of Large Factor VIII Gene Chromosomal Inversions in Hemophilia A Patient-Derived iPSCs Using CRISPR-Cas9[J]. Cell Stem Cell, 2015, 17(2): 213-220.

Burnight E R, Gupta M, Wiley L A, et al. Using CRISPR-Cas9 to Generate Gene-Corrected Autologous iPSCs for the Treatment of Inherited Retinal Degeneration[J]. Molecular Therapy, 2017, 25(9): 1999-2013.

Xu H, Wang B, Ono M, et al. Targeted Disruption of HLA Genes via CRISPR-Cas9 Generates iPSCs with Enhanced Immune Compatibility[J]. Cell Stem Cell, 2019, 24(4).

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

根据科研需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

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