CRISPR / Cas9基因敲除CHO细胞系的作用分析-源井生物_风闻

“基因敲除CHO细胞系”（中国仓鼠卵巢细胞）是源自中国仓鼠卵巢细胞的实验室培养的细胞系技术。中国仓鼠是一种流行的实验室哺乳动物，部分原因是它们的体积小且染色体数少，使其成为组织培养和放射学研究的良好模型。CHO细胞是生物学，医学和药学研究中常用的哺乳动物细胞模型。另外，它们通常用于商业目的以产生治疗性重组蛋白。对治疗性蛋白质的需求不断增长，导致了在CHO表达系统中促进高质量和高生产率的技术的发展。已经建立了CHO培养过程，使用CHO细胞生产治疗性蛋白质的成本与微生物培养的成本相当。

使用CRISPR/Cas9和荧光富集产生三重敲除CHO细胞系

先前已经证明，CRISPR / Cas9基因编辑技术是用于CHO细胞基因破坏的有效工具。稳定的细胞系在这项研究中，研究人员通过在CHO细胞的多个环境被同时破坏FUT8，BAK和BAX，进一步证明了CRISPR/Cas9基因组编辑的适用性和效率。为了从转染的细胞库中分离出表达Cas9的细胞，GFP通过2A肽与Cas9核酸酶连接。使用这种方法，在三个基因组位点产生的平均插入缺失频率从富集前的11％增加到富集后的68％。尽管在富集的细胞池中存在大量的基因组编辑事件，但从脱靶预测然后进行深度测序均未观察到明显的脱靶效应。对富集的多重细胞进行单细胞分选，并对97个克隆进行深测序，发现有4个单基因，23个双基因和34个三基因破坏的细胞系。如预期所选的，对选定的潜在三方敲除克隆的进一步表征证实了Bak和Bax蛋白的去除并破坏了岩藻糖基化活性。与野生型CHO-S细胞相比，敲除细胞系显示出对凋亡的增强抵抗力。总之，与CRISPR/Cas9的多路复用可以进一步加速CHO细胞中的基因组工程工作。

敲除难以去除的CHO宿主细胞蛋白脂蛋白脂肪酶，以提高单克隆抗体制剂中山梨酸酯的稳定性

尽管大多数宿主细胞蛋白（HCP）杂质在典型的下游纯化过程中已被有效去除，但是一小部分HCP尤其具有挑战性。先前的研究已经确定了由于多种原因而具有挑战性的HCP。脂蛋白脂肪酶（LPL）是中国仓鼠卵巢（CHO）HCP，具有水解甘油三酸酯中的酯的功能。它是先前研究中确定的十种HCP之一，很容易保留在下游的加工中。由于聚山梨酯和甘油三酸酯之间的结构相似性，LPL可能会使最终产品配方中的聚山梨酯80（PS-80）和聚山梨酯20（PS-20）降解。在这项工作中，发现重组LPL在一系列mAb制剂的典型溶液条件下对PS-80和PS-20具有酶促活性。使用CRISPR和TALEN技术创建LPL基因敲除CHO细胞。与野生型样品相比，所得细胞培养物收获物证明聚山梨酯降解显着降低，而对细胞生存力没有显着影响。

优化CRISPR / Cas9策略，可在CHO细胞中进行同源性导向的转基因多靶点整合

特定于站点的整合已成为一种精准的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系工程和可预测的细胞系发育（CLD）的前途和策略中。具有同源性定向修复（HDR）途径的CRISPR / Cas9能够将转基因精确整合到目标基因组位点中。然而，对转基因的HDR介导的靶向整合（TI）固有的顽固性导致靶向效率低下，因此需要选择过程才能在CHO细胞中找到靶向整合体。研究人员使用基于启动子-Trap的单或双敲入（KI）监视系统探索了几个影响目标效率的参数。与传统的环形供体质粒相比，增加了单向导RNA识别序列对供体模板设计进行的简单更改，可显着提高KI效率（2.9–36.0倍），取决于整合位点和细胞培养模式，可提高KI效率。此外，顺序和同时进行的KI策略使我们无需额外的富集程序即可获得约1-4％的双KI细胞群体。因此，这种简单的优化策略不仅可以在CHO细胞中实现高效的CRISPR/Cas9介导的TI，而且还为在一个实验步骤中多重KI的适用性铺平了道路，而无需顺序和独立的CHO-CLD程序。

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Reference

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基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

根据科研需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

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