基因敲除诱导型细胞系_风闻

1.开发用于大规模功能筛选的药物诱导性CRISPR-Cas9系统

应用基因敲除CRISPR/Cas9技术的大规模基因筛选，现已成为了发现和验证基因功能的有力方法。在CRISPR细胞敲除筛选的过程中，控制基因扰动时间的能力将有助于精确解剖动态和复杂的生物过程。据报道，药物诱导的CRISPR-Cas9系统的优化，允许在时间的控制下进行高通量基因询问。

研究人员设计了多种药物诱导的sgRNA表达载体，并使用EGFP基因破坏测定法在11种人的原代细胞和小鼠细胞系中测量了它们的活性。最佳设计可在体外和体内对基因敲除进行严格且可诱导的控制。接下来，使用诱导型和组成型CRISPR-Cas9系统进行全基因组并行功能丧失筛选。在基于增殖的辍学筛选中，这两种方法在区分必需的基因和非必需的基因方面具有相似的性能。在需要细胞因子刺激和细胞染色的更具挑战性的表现分析中，科学家观察到本构和药物诱导筛选方法在检测已知命中中具有相似的敏感性。重要的是，在大规模设置中，在没有化学诱导剂的情况下，我们的可诱导CRISPR筛选平台的最小泄漏。

2.用诱导型CRISPR/Cas9在人细胞中进行有条件的基因敲除

易于编程和高效的CRISPR/Cas9核酸酶系统的出现彻底改变了基因工程。尽管使用CRISPR/Cas9进行常规基因敲除实验非常有价值，但它们并不十分适合研究动态情况（例如发育或疾病）中特定阶段的基因功能。在这里，我们描述了一种基于CRISPR/Cas9优化诱导型的基因敲除方法，用于人类细胞中的条件性功能丧失研究。此方法依赖于改进的四环素诱导系统，用于条件表达驱动Cas9活性的单向导RNA（sgRNA）。为了确保均匀且稳定地表达，在对AAVS1基因组安全筛选中，能高效的进一步遗传工程后，表达了必要的转基因。当在人类多能干细胞（hPSC）中实施时，该方法实际上可以有效地应用于处于发育或疾病各个阶段的任何hPSC衍生的人类细胞类型。

3.使用CRISPR/Cas9基因工程技术诱导人类基因敲除人类干细胞

人类多能干细胞（hPSC），包括胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC），是阐明人类遗传背景下早期发育和疾病发病机制中调控过程的有用工具。基因修饰，包括基因敲除（KO），进一步扩展了hPSC在研究人类胚胎发生或人类遗传疾病中的基因功能方面的实用性。因此，对hPSC中的基因敲除KO进行精确的时间控制通常对于阐明构成复杂人类特征基础的基因功能和分子途径通常是必要的或非常有益的。基因表达或缺失的精确时间控制对于阐明生物系统中的基因功能至关重要。然而，具有诱导基因敲除（iKO）的人类多能干细胞（hPSC）系的建立仍然具有挑战性。因此，科学家探索了通过将CRISPR/Cas9介导的基因组编辑与Flp/FRT和Cre/LoxP系统相结合来构建iKO hPSC系的方法，并进一步开发了一种策略，可以同时插入一个活性可控制的重组酶表达盒，并去除耐药基因加快了iKO hPSC品系的产生。此两步策略用于建立人类胚胎干细胞（hESC）和具有iKO的多能干细胞（iPSC）系，即SOX2，PAX6，OTX2和AGO2的iKO，这些基因表现出不同的结构布局和时间的表达模式。 iKO hPSC系的可用性将大大改变我们检查人类细胞基因功能的方式。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成人糖基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

根据科研需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

Reference:

5 Contributions HeLa Cells Have Made to Science. Cell Science from Technology Networks. Retrieved 2020-03-25.

Yao Ye-bao, Wang Guang-fei, Dong Qing-cai, Cao Cheng. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system, Military Medical Sciences, 2019,42(1):1-5.

Huang Rongfu, Peng Weilin, Lin Jiansheng, Lian Jianfeng, Yang Xiaoyu, Zheng Ming. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system. Military Medical Sciences, 2017,41(5):359-362

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