一次读懂基因敲除Vero细胞系-源井生物_风闻

Vero细胞起源于1960年代3月27日的正常成年非洲绿猴的肾脏，是微生物学以及分子和细胞生物学研究（包括涉及对基因的编辑等研究）中最常用的哺乳动物基因细胞系之一。作为需要CRISPR / Cas9技术的基因敲除/敲入。在第93代时，该细胞系被带到美国国立卫生研究院的国立过敏和传染病的研究所，并于1966年提供给美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

Vero细胞系也是锚固依赖性细胞系，已广泛用于病毒学研究，但也已用于许多其他方面的细节观察，包括细胞内细菌和寄生虫的繁殖和研究，以及化学物质，毒素作用的评估，以及哺乳动物细胞上分子水平的其他物质。因此，基因编辑的Vero细胞，在这些领域的研究中越来越受欢迎。此外，Vero细胞已在美国获得生产活疫苗（轮状病毒，天花）和灭活（脊髓灰质炎病毒）疫苗的许可，并且在世界范围内，Vero细胞已用于生产其他几种病毒，包括狂犬病病毒，呼肠孤病毒和日本脑炎病毒。这些研究主要与Vero CRISPR / cas9哺乳动物细胞，Vero敲除细胞系，慢病毒包装和Vero点突变细胞系有关。 Vero细胞也可以用作真核耳寄生虫（如锥虫）的宿主细胞。

图1

图1. Vero 76细胞（ATCC＃CRL-1587），约95％单层。这些细胞将需要在一天之内进行继代培养。

Vero细胞在传代培养过程中生长良好，并发现清晰的细胞膜边界和良好的细胞质透明度。

Vero细胞的形态相对完整，细胞增殖速度也相对较快。将Vero细胞转移到烧瓶中后，在培养24小时后可以粘附。培养三天后，细胞可以达到相对静止的阶段。细胞可以在培养的第五天长成单层细胞，并且可以培养到第十二天。发现生长茂密，细胞开始老化直到第十四天。旋转后的细胞生长速度比旋转前慢，但是单层细胞的持续时间比旋转前更长。在支原体检查期间未发现支原体生长和污染。细胞类型分析结果表明，Vero细胞的核型无明显异常，染色体数无明显变化。

Vero细胞系的应用：

Vero细胞可用于多种研究目的。 Vero细胞广泛用于病毒感染的分子机制研究，疫苗生产和重组蛋白。发现Vero细胞在建立后不久就对许多类型的病毒高度敏感，包括猿猴液泡病毒，麻疹病毒，风疹病毒，节肢动物传播的病毒和腺病毒。后来发现它对细菌毒素敏感，包括白喉毒素，不耐热肠毒素和志贺样毒素。因此，Vero细胞适合作为基因定制模型，例如涉及病毒感染的CRISPR敲除细胞。

1，利用基因敲除的Vero细胞系提高病毒疫苗的生产

疫苗生产成本高昂，阻碍了全球抗击疾病的疫苗的采用。本文描述的工作遵循了之前的两个出版物，它们报告了通过对大规模疫苗生产中使用的Vero细胞系进行基因修饰来增强脊髓灰质炎病毒和轮状病毒疫苗生产的策略。 CRISPR / Cas9基因编辑工具被用于敲除先前显示在脊髓灰质炎和轮状病毒生产中起作用的Vero目标基因。随后，开发了当前行业制造系统的小规模模型，并采用该模型来评估多种稳定的敲除细胞系对脊髓灰质炎和轮状病毒产量的增加。与以前的研究不同，Vero敲除细胞系未能实现所需的目标产量增加。这些发现表明，在脊髓灰质炎和轮状病毒疫苗的生产过程中实施基因工程改造的Vero细胞系之前，需要进行更多的研究，以便能够以较低的价格提供疫苗。

2，基因编辑的Vero细胞作为轮状病毒疫苗的底物

轮状病毒（RV）是全球范围内严重肠胃炎的主要原因，可导致5岁以下儿童大量与肠胃炎相关的疾病。口服减毒活减毒RV疫苗可以预防疾病，但是高制造成本和冷链维持通过siR鉴定了病毒细胞宿主基因的一个子集。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成人糖基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

根据科研需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

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