这是基因敲除KYSE-150细胞系的成功秘籍-源井生物_风闻

KYSE-150细胞是分化差的食道腺癌细胞，是从一名接受放射疗法的49岁日本女性患者的颈部食道中分离出来的。当研究人员发现该细胞系时，患者的癌组织已侵入邻近的组织。

KYSE-150细胞系是具有粘附单层的上皮细胞。据报道，细胞携带的致癌基因c-erb-B（8倍）和细胞周期蛋白D1（4倍），并且细胞可以在裸鼠中形成肿瘤，因此KYSE-150细胞系经常用于涉及基因编辑的癌症研究中，例如CRISPR基因敲除/敲入和点突变。

应用范围：

1**. 在KYSE-150细胞中敲除EZH2改变了PSMA3-AS1诱导的食管癌细胞增殖和迁移**

在食管癌患者中，PSMA3-AS1表达上调并且与肿瘤大小和转移呈正相关。为了进一步探索PSMA3-AS1在食管癌细胞中的生物学作用，研究人员通过慢病毒感染在KYSE150和KYSE450细胞株（PSMA3-AS1表达较低）中建立了稳定的CRISPR PSMA3-AS1过表达细胞株，并验证了其上调RT-qPCR检测PSMA3-AS1。

EZH2的CRISPR / Cas9基因编辑已在KYSE150和KYSE450细胞中成功进行，并通过EZH2蛋白表达的显着降低得到证实。 CCK-8和集落形成分析表明，敲除CRISPR EZH2后，PSMA3-AS1的过表达并不影响食道癌细胞的增殖（图6B和6C）。根据伤口愈合和transwell迁移分析，与阴性对照细胞相比，ESCC EZH2敲除KYSE-150细胞的伤口愈合和细胞迁移没有增加。

临床病理特征表明，PSMA3-AS1表达增加与远处转移，较大的肿瘤大小和ESCC患者的预后不良呈正相关。

2. CRISPR过表达的KYSE-150细胞增加ESCC中的化学抗性

基于全基因组簇的规则间隔的短回文重复序列/基于CRISPR的慢病毒文库（CRISPR / Cas）是用于基因组规模功能获得或功能丧失筛选的强大工具。该系统已被证明在体外鉴定耐药基因方面非常有效。 Shalem，Kurata和Joung使用CRISPR基因敲除文库筛选出了黑色素瘤和AML耐药性的基本基因。一些研究人员试图将CRISPR文库筛选策略与RNA测序技术结合在KYSE-150细胞中，以探索ESCC的关键基因和抗化学性的潜在机制。

为了增加鉴定参与PTX抗性的必要基因的机会，进行了综合分析，以将基因组规模CRISPR筛选中的EN基因与KYSE-150细胞系中的差异表达基因（DE基因）结合起来。

研究人员评估了CDKN1A，ELAVL2和TSPAN4增强ESCC细胞KYSE-150的化学耐药性的潜力。结果表明，CDKN1A，ELAVL2或TSPAN4的过表达可以显着增加KYSE-180和KYSE-150细胞对PTX的抗性。此外，过表达的CDKN1A，ELAVL2或TSPAN4也可能有助于KYSE-150细胞的DDP抗性。

3. CRISPR / Cas9介导的KYSE-510细胞中DEPTOR的敲除显着促进细胞增殖，迁移和侵袭

研究人员发现，DEPTOR的表达负调节ESCC细胞系的致瘤活性。此外，异位DEPTOR表达引起KYSE150细胞的细胞增殖，迁移和侵袭的显着抑制，而KYSE150细胞的DEPTOR表达水平最低。同时，CRISPR / Cas9介导的KYSE-510细胞中DEPTOR的敲除显着促进了细胞的增殖，迁移和侵袭。此外，体内试验进一步显示，与未经处理的KYSE150细胞相比，异位DEPTOR表达的异种移植物中的肿瘤生长被显着抑制，而在DEPTOR基因敲除的KYSE-510细胞中肿瘤生长明显增强。

在这项研究中，科学家们产生了稳定的细胞系，这些细胞系要么过度表达DEPTOR，要么通过遗传消除内源性DEPTOR表达。由于KYSE-150在三种细胞系中表达最低的内源性DEPTOR，因此它们在KYSE-150细胞（pcDNA3.1-DEPTOR）中稳定地过表达DEPTOR。出于相同的考虑，用CRISPR/Cas9系统处理表达最高水平DEPTOR的KYSE-510细胞，以敲除DEPTOR（CRISPR-DEPTOR）。细胞系生成后，与KYSE-150亲代细胞和空载体转染的细胞相比，pcDNA3.1-DEPTOR表现出降低的细胞增殖速率，而CRISPR-DEPTOR细胞的增殖明显快于对照KYSE-510细胞。此外，pcDNA3.1-DEPTOR细胞也显示出减少的迁移。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成人糖基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生产生产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据科研需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

References:

1. Yan-Mei Ji, Xue-Feng Zhou, Jun Zhang, Xiang Zheng, Sheng-Bao Li, Zhi-Qiang Wei, Tao Liu, Dong-Liang Cheng, Ping Liu, Kuncheng Song, Tao Tan, Hua Zhu, Jia-Long Guo. DEPTOR suppresses the progression of esophageal squamous cell carcinoma and predicts poor prognosis. 2016 Mar 22; 7(12): 14188–14198. Published online 2016 Feb 16.

2. Qiu BQ, Lin XH, Ye XD, et al. Long non-coding RNA PSMA3-AS1 promotes malignant phenotypes of esophageal cancer by modulating the miR-101/EZH2 axis as a ceRNA. Aging (Albany NY). 2020;12(2):1843‐1856.

3. Zhao, Wen-Si et al. “Genome-scale CRISPR activation screening identifies a role of ELAVL2-CDKN1A axis in paclitaxel resistance in esophageal squamous cell carcinoma.” American journal of cancer research vol. 9,6 1183-1200. 1 Jun. 2019

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