一文读懂基因敲入细胞系原理_风闻

基因敲入细胞系

通过核转染法将gRNA、Cas9和Donor共转入细胞中，进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出敲入纯合的阳性克隆。敲入荧光报告基因的也可以通过观察荧光进行初步筛选。

敲入方案

特定位点融合蛋白：

gRNA和Cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，细胞以外源携带敲入片段的Donor作为模板进行同源重组修复（HDR），将敲入片段重组到基因组靶位点。

敲除特定基因同时敲入外来基因片段：

服务流程及质量控制

应用案例

携带嵌合抗原受体（CARs）的T细胞可以介导肿瘤排斥反应，是治疗B细胞恶性肿瘤的有效方法。通过CRISPR-Cas9技术，在T细胞中，利用Donor载体同源重组将具有CD19特异性的CAR片段替代TRAC基因，不仅可以在人外周血T细胞中获得均匀的CAR表达，而且还可以增强T细胞的免疫应答能力。

CRISPR/Cas9靶向CAR基因整合入TRAC位点。

1928z是具有CD19特异性的CAR片段

TCR/CAR流式图

Cas9，gRNA 和donor同时存在时，4天后能检测到敲入蛋白CAR的表达。

Reference：

Eyquem, J., Mansilla-Soto, J.,Giavridis, T., van der Stegen, S. J., Hamieh, M., Cunanan, K. M., …& Sadelain, M. (2017). Targeting a CAR tothe TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature, 543(7643), 113.

来源 | 源井生物

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