CRISPR-U™稳转细胞株敲除(详细科普)_风闻

CRISPR-U™基因编辑细胞系原理

CRISPR-U™是源井生物自主研发的基因编辑技术（基于CRISPR / Cas9技术），CRISPR-U™技术比普通CRISPR/Cas9技术的基因切割效率更高，同时可以大幅度提升同源重组效率，轻松实现细胞和动物水平的基因敲除（KO）、基因点突变（PM）和基因敲入（KI）。利用CRISPR-U™的技术优势，源井生物已成功在超过100种细胞系上实现基因编辑。

CRISPR/Cas9系统的原理是利用gRNA特异性识别靶序列，并引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割，从而造成靶位点DNA双链断裂，随之利用细胞的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）的方式对切割位点进行修复，实现DNA水平的敲除、敲入或点突变。

源井生物100种基因编辑细胞成功案例

技术优势

基因敲除细胞系

通过病毒法，化学转染法或电转法将gRNA和Cas9转入细胞中，根据转染方法不同进行不同时长的药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出基因敲除的阳性克隆。

常见基因敲除细胞系类型

敲除方案

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行敲除方案设计。

服务流程及质量控制

应用案例

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞被用作生物工厂，用于生产一系列重组治疗蛋白，包括单克隆抗体和Fc融合蛋白。宿主细胞蛋白（HCP）是必须从治疗制剂中去除的杂质，因为它们具有潜在的免疫原性风险。虽然在典型的下游净化过程中，大多数HCP杂质被有效去除，但清除少量存在的HCP仍然是一个挑战。利用CRISPR/Cas9系统建立Anxa2和Ctsd基因敲除CHO细胞系，并证实了细胞裂解液中HCP完全消除。在培养过程中，所有的敲除细胞系都显示出与野生型对照相似的生长和活力。因此，敲除非必需基因可以减少重组治疗蛋白生产中HCP的污染。

用SDS-PAGE和WB分析鉴定CHO基因敲除细胞株的蛋白表达。

（a） Anxa2基因敲除细胞系。

（b） Ctsd敲除细胞系。细胞培养上清液（47μg蛋白）和细胞裂解液（20μg蛋白）经4-20%SDS-PAGE分析。

CBB染色检测总蛋白。利用各自的捕获和检测抗体对每个蛋白质进行WB分析。星号表示非特定波段。双星号表示组织蛋白酶D的片段。

在蛋白质表达分析中，没有观察到CHO-K1（WT）细胞系中的细胞培养上清液中的膜联蛋白A2和组织蛋白酶D。对贴壁的CHO-K1细胞进行静态培养，在培养过程中没有物理应力诱导细胞裂解，这表明CHO细胞分泌的这些蛋白质数量相当少。此外，在对Anxa2和Ctsd基因敲除细胞系的蛋白质表达分析中，没有观察到任何截短的HCP。

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Reference：

Fukuda, N., Senga, Y., & Honda, S.(2019). Anxa2‐and Ctsd‐knockout CHO cell lines to diminish the risk of

contamination with host cell proteins. Biotechnology progress, e2820.

来源 | 源井生物

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