circRNA敲除细胞株 - 揭秘其对基因调控的重要作用_风闻

环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是一类由mRNA 前体(pre-mRNA)经反向剪接形成的共价闭合环状非编码RNA。CircRNA最早是在上世纪70年代在病毒中被发现，但是由于早期RNA文库制备广泛使用polyA富集的方式（circRNA没有游离的5’和3’末端），以及RNA-seq读数要求以线性方式与基因组对齐的计算算法，导致大量circRNA的信息被遗漏，使得人们一度认为环状 RNA 只是错误剪接的副产物，对circRNA的关注并不高。

随着高通量测序技术和生物信息学的发展，成千上万种circRNA被发现，围绕着circRNA的基础研究也越来越多。大量研究表明circRNA在哺乳动物细胞中具有内生、丰富、保守、稳定等特点，并经常表现出组织或时空特异性，可以通过多种机制参与机体生长发育调控，以及疾病的发生和发展。因此，近年来circRNA逐渐成为非编码RNA研究领域的热点。

circRNA与疾病的关系

目前研究最多的是circRNA与实体瘤之间的关系，促进肿瘤生成的一些circRNA，如头颈部鳞状细胞癌中的circPvt1；结直肠癌、食道鳞状细胞癌和肝细胞癌中的cirs-7（CDr1as）。抑制肿瘤的circRNA，如胶质母细胞瘤中的circsMARCA5 和 circ-SHPRH。还有一些circRNA在不同组织或不同细胞所起的作用可能不同，如circHiPK3，在直肠癌中是原癌基因，但是在膀胱癌中又是抑制癌细胞的。

除了癌症，研究还发现circRNA与糖尿病，心血管疾病，慢性炎症和神经系统疾病都有密切的关系。相信随着生物技术的发展以及越来越多对circRNA的深入研究，circRNA的形成和作用机理可以更加清晰，在疾病预防，诊断及治疗方面也可以起到重要的作用。

circRNA  的基因编辑与调控，为疾病研究与治疗助力！

circRNA涉及许多复杂的功能，那一般是如何对它的功能进行研究的呢？和编码基因类似，常见的做法是将该circRNA敲除（降）或者进行过表达，下面我们介绍下几种最常用的circRNA基因编辑与调控。

CRISPR/Cas9技术敲除特定circRNA，揭秘其对肿瘤形成的调控机制

circRNA敲除是指在基因DNA水平进行编辑，达到彻底敲除的目的。最常用的是在circRNA

exon的两端设计2条gRNA，敲除整个环化的外显子序列。这种方案虽然可以敲除circRNA，但是在敲除circRNA的同时，也会影响到编码蛋白的亲本基因，对于其功能的研究并不太理想。

由于对亲本基因影响较大，目前越来越多研究者已经放弃使用这种方案敲除circRNA，比较理想的方法是敲除外显子侧翼内含子中的成环元件，来达到破坏circRNA成环同时又不影响编码基因表达的目的。但是这种circRNA敲除方案比较难设计，许多初入门者很难掌握设计打靶方案的逻辑。

以circ-HIPK3为例，circ-HIPK3是人体细胞内含量丰富的一种环状RNA，它可以与多种miRNA结合，作为细胞生长的调节剂，影响肿瘤的形成。为了验证circ-HIPK3成环的机制，需要找到侧翼内含子中的成环元件，对上下游预测的两个成环元件分别设计一对sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统将预测的成环元件进行敲除，检测circRNA表达情况是否发生变化。经过PCR和RT-QPCR验证，发现下游成环元件敲除后，circHIPK3表达明显下调，而上游成环元件敲除后，circHIPK3的表达不仅没有下调还有所升高。推测可能是上游的成环元件序列太多，预测的不准确。为了进一步验证是其他成环元件驱动的成环，将gRNA3或gRNA4分别与gRNA5或gRNA6共注射，敲除成环元件上游大片段内含子。RT-QPCR结果显示circHIPK3表达确实下降了，说明上游是由其他的成环元件起到成环的作用。

源 井 生 物 凭借丰富的基因编辑方案设计经验，对circRNA设计敲除外显子侧翼内含子中的成环元件的方案，来达到破坏circRNA成环同时又不影响编码基因表达的目的。结合CRISPR-U™高效编辑技术，效率是普通方法的10倍，可以快速筛选出circRNA敲除的阳性克隆。

敲降特定circRNA，揭秘其对细胞增殖和凋亡的调控机制

在研究circRNA功能的方法中，最经典的抑制circRNA的方法是通过RNAi的方式（shRNA）进行敲降。为了避免影响到mRNA，设计方案时需将干扰序列设计在反向剪接位点处。利用siRNA对circ-HIPK3进行干扰，观察circ-HIPK3敲降后，是否会影响细胞增殖或者凋亡。首先设计三组实验，分别针对HIPK3 mRNA线性转录本、circ-HIPK3环状转录本和两种转录本共有部分设计siRNA，并在HEK-293 T细胞系上验证设计的siRNA只干扰相应的转录本。利用增殖凋亡检测试剂盒：CCK-8和EdU进行细胞增殖凋亡检测，结果显示HIPK3 mRNA敲降后不明显影响细胞增殖，而circ-HIPK3敲降后，会明显抑制细胞增殖。

源井生物可通过设计高效的shRNA，用慢病毒法将干扰载体转入细胞中，根据最佳药筛浓度对细胞进行药物筛选，直到对照组细胞全部死亡，获得circRNA敲降的稳定细胞株。

过表达特定circRNA，揭秘其成环机制

circRNA过表达一直有成环效率低，容易错配成环等难点。通过优化侧翼成环框架，如成环元件、QKI等RBP的结合位点，使circRNA准确高效环化。过表达后仍需要检测是否成功成环，以及线性mRNA是否表达。为了研究一种新环状RNA载体表达系统的成环效率，选择小鼠circRtn4环状基因在多种细胞系（包括Hela，N2a，HEK293）中进行表达验证。根据不同细胞系中进行的RT-QPCR实验数据显示，新载体系统pCircRNA-DMo-Rtn4成环效率在几种不同的细胞系中均比普通的载体系统（pCircRNA-BE-Rtn4）要高效得多。

参考文献：

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