中国科学家的下一代育种技术：IMGE，作物育种的“马良神笔”_风闻

近几十年来，得益于作物品种的改良和生产方式的改变（如密植、农药、化肥的使用等），作物产量（特别是单产）的稳步提高为世界人口的增长发挥了关键的支撑作用。作物品种的改良主要得益于育种带来的遗传增益（Genetic Gain）。 然而传统育种中优良性状的针对性改良，需要将带有该优良性状或基因的材料（供体亲本）与所需改良的材料（受体亲本）杂交，再经过6-8代的回交和繁琐的背景选择，最终从后代中选择出其他性状像受体亲本、同时携带来自于供体亲本优良性状或优异基因型的个体，用于下一步的育种。这个过程费时，费力，成本高昂，而且由于受制于表型观察准确性和遗传累赘效应等影响，所得的结果并不总能与预期目标相符。因此，生产上迫切需要一种能够快速、精准改良作物性状的育种方法，以加快作物育种的进程。

近年来，随着分子生物学、基因组学和农业生物技术的发展，涌现出了一批新的作物育种技术，如双单倍体技术、转基因技术、分子标记辅助育种技术、基因组编辑技术、智能不育技术（第三代杂交水稻育种技术）、杂种优势固定技术（无融合生殖技术）等。其中双单倍体技术在玉米、小麦、大麦、烟草等作物的育种中已得到广泛应用。通过与单倍体诱导系（haploid inducer）杂交，可快速创制不受遗传背景限制的单倍体，再通过人工或自然染色体加倍成为双单倍体（doubled haploid）, 实现在短时间内（两代）作物优良基因型的固定，从而创制纯合的自交系以用于杂交育种或品种选育。以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术是最近发展起来的一种在体内高效精准改变DNA的方法，可用于农作物高产、抗逆、优质等性状的精准改良，为将来农作物的选育提供了一种新的革新性的工具。然而，基因组编辑技术的应用涉及作物的遗传转化，而目前大多数作物，特别是优良的商业化品种的遗传转化效率很低。因此通常采用的策略是先在一个可转化的基因型中用CRISPR/Cas9技术编辑目标基因（赋予一方面或几方面性状的改良），然后将编辑后的目标基因通过杂交和多世代回交的方法导入到商业化品种中，整个过程常常需要3-5年的时间，周期漫长，大大限制了该技术在商业化育种中的应用效率。同时，为了实现编辑后等位基因的稳定遗传和保证所改良育种材料中不包含外源转基因成分，基因编辑育种最终还需要将CRISPR载体去除，不可避免的额外增加育种的复杂性和成本。

近日，来自中国农业科学院生物技术研究所和华南农业大学的科研人员报道了一种称为IMGE (Haploid Inducer-mediated Genome Editing)的育种策略，巧妙地将单倍体诱导与CRISPR/Cas9基因编辑技术结合起来，成功地在两代内创造出了经基因编辑改良的双单倍体（DH）纯系。该方法可以打破之前基因编辑育种对材料遗传转化能力的依赖，并且创造出不含转基因（CRISPR载体）的纯系。相关研究成果以 Development of a Haploid-Inducer Mediated Genome Editing (IMGE) System for Accelerating Maize Breeding 为题发表在国际知名期刊 Molecular Plant 上。

该方法的技术路线是先将一个改良目标农艺性状的CRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的转化方法导入到一个可转化的玉米品种中（如ZC01, B104）, 然后通过杂交、Basta除草剂抗性筛（保证CRISPR/Cas9载体的成功导入）和特异性分子标记检测（保证含有单倍体诱导基因MATL）将该CRISPR/Cas9载体导入到单倍体诱导系中，创制出携带有CRISPR/Cas9载体的单倍体诱导系。之后用携带有CRISPR/Cas9载体的单倍体诱导系做父本与任何商业化自交系（如B73）杂交，根据F1种子胚的颜色挑选出候选单倍体种子（单倍体种子胚是无色的，而正常受精得到的二倍体种子为紫色）。再根据候选单倍体的田间表现确定单倍体植株（单倍体植株与正常二倍体野生型相比，往往个体较小，发育较慢）。然后根据目标性状的变化（如叶夹角的变化）和CRISPR/Cas9的靶位点的测序分析筛选出靶位点被编辑的单倍体。这些单倍体可以通过人工或自然染色体加倍成为纯合的经过基因编辑（目标性状得到改良）的二倍体植株，从而实现在两代内创制性状改良的商业化玉米品种双单倍体（edited doubled Haploid, edited-DH line）, 从而可以大大加速作物育种的进程 （流程见图1）。

图1：技术路线图

利用这个技术，研究人员对玉米骨干自交系B73中的ZmLG1（控制叶夹角）和 UB2（控制雄穗分枝数）两个基因进行了成功的编辑，获得了这两个位点改造成功的单倍体，并通过自然染色体加倍，获得了编辑成功的双单倍体（图2）。通过分子标记检测和测序分析，确认了CRISPR/Cas9介导的基因编辑的确发生在B73背景中，而不是在诱导系(CAU5)本身中。进一步的Basta抗性筛选和特异分子标记检测确认了编辑的单倍体不含有转基因成分（不含有CRISPR载体）。因此，利用这项技术可实现任何商业化品种中（完全不受基因性的限制）目的基因的高效精准改良，从而摆脱现有转基因技术和基因编辑体系受遗传背景的限制。此外，利用本技术创制的单倍体的双单倍体材料都不含有转基因，因此有利于消除消费者顾虑和国家转基因政策监管。同时，本技术的成功也为玉米单倍体的形成机制提供了强有力的证据，支持玉米单倍体是受精后父本的基因组丧失，而不是由未受精的卵细胞通过孤雌生殖形成的。

图2：利用IMGE技术成功编辑玉米B73自交系ZmLG1基因。 A.未被编辑的玉米B73自交系、一个成功编辑的lg1单倍体(D32-17)和一个未被编辑的单倍体(D39-3)的植株表型； B. 未被编辑的玉米B73自交系、一个成功编辑的lg1单倍体(D32-17)和一个未被编辑的单倍体(D39-3)的叶夹角表型； C. B73野生型和编辑成功的lg1单倍体(D32-17)中ZmLG1基因靶位点的序列比较； D. B73、CAU5LG1-Cas9、lg1-Haploids中ZmLG1基因靶位点上游侧翼序列的比较；E-G: B73、D32-17和D39-3中DNA定量分析； H. B73、D32-17、D39-3和CAU5中MATL基因的特异性分子标记分析。

值得指出的是，该技术与最近先正达公司科研人员提出了HI-Edit育种策略【1】不谋而合。 这两份完全独立的研究报道为该策略的可靠性提供了进一步的佐证。有趣的是，先正达研究人员还发现HI-Edit技术可以和CENH3系统结合用于双子叶植物的改良。而且利用携带有Cas9-TaGT1s 载体的玉米转基因植株的花粉授予到被去雄的小麦品种AC Nanda或者胞质雄性不育系（CMS）植株的柱头上（远源杂交），通过胚拯救的方式成功获得经基因编辑改良的小麦单倍体植株。

近年来，新的基于油分含量和荧光蛋白标记等技术的工程化单倍体诱导系统已经被成功开发，同时，目前基因编辑技术的发展已允许多个基因的同时编辑，实现多性状的同时改良。这些技术的结合将大大提升IMGE的效率和便捷性，使其在工程化育种方面大显身手。另一方面，单碱基编辑、基因替换、基因敲入技术等新型基因编辑技术的发展，将为IMGE技术的应用提供更强的灵活性、机动性和可控性。此外，除玉米、小麦外，水稻、大麦、烟草等植物中都已有成功的单倍体诱导系统的建立。可以预期IMGE与它们的结合将大力推动新一代育种技术的发展和整合，大大加快现代化作物育种的进程和效率，使这些技术像“马良神笔”一样在作物育种的征程上描绘出壮丽的华章。

鉴于该技术潜在的重大应用前景，Molecular Plant 编辑部同期以 Next-Generation Crop Breeding Methods 为题发表了Editor’s Highlights 评述性文章，认为IMGE（或HI-edit）技术与之前报道的利用基因组编辑技术获得无融合生殖株系，从而实现杂种优势快速固定的技术【2,3】有望成为一批新的下一代作物育种技术，预期在今后的作物育种中将得到广泛应用。

IMGE（HI-Edit）育种流程

中国农业科学院生物技术研究所的王宝宝（助理研究员）和祝蕾博士为本研究的共同第一作者，王宝宝和华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室王海洋教授为共同通讯作者。本研究得到了国家重点研发计划项目 、北京市自然基金项目和华南农业大学高水平大学建设经费的支持。

王海洋教授曾任美国康奈尔大学Boyce Thompson 植物研究所和耶鲁大学分子、细胞与发育生物学系独立课题负责人，长期从事植物应答光信号和植物激素反应的分子、细胞和生化调控机制的研究，以及水稻、玉米重要农艺性状遗传与分子调控机理的解析。迄今共发表高水平SCI论文90余篇，曾以第一或通讯作者（含共同通讯）在Science 和Nature发表4篇研究论文，全部论文近5年被他引近2000次。一项成果被评为2014年度中国科学十大进展。在国家作物分子设计工程技术研究中心任职期间（2009-2013年），与邓兴旺教授合作成功研发了第三代杂交水稻育种技术。王海洋教授于2009年入选北京市海外高层次人才和中关村高端领军人才；2013年入选中国农业科学院“青年英才”计划， 担任中国农业科学院生物技术研究所研究员和玉米功能基因组创新团队首席科学家；2015年入选全国农业科研杰出人才。2016年入职华南农业大学，担任生命科学学院教授。

参考文献

1. Kelliher, T., Starr, D., Su, X., Tang, G., Chen, Z., Carter, J., Wittich, P.E., Dong, S., Green, J., Burch, E., et al. (2019). One-step genome editing of elite crop germplasm during haploid induction. Nat. Biotechnol. 37:287-292.

2. Wang, C., Liu, Q., Shen, Y., Hua, Y., Wang, J., Lin, J., Wu, M., Sun, T., Cheng, Z., Mercier, R., et al. (2019). Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes. Nat. Biotechnol. 37:283-286

3. Khanday, I., Skinner, D., Yang, B., Mercier, R., and Sundaresan, V. (2019). A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds. Nature 565:91-95.

原文链接：

www.cell.com/molecular-plant/fulltext/S1674-2052(19)30097-8

评论链接：

www.cell.com/molecular-plant/fulltext/S1674-2052(19)30098-X

来源：BioArt植物